Μόλις τα κύτταρα εμφανιστούν αποκολλημένα, προσθέστε 2 όγκους προθερμασμένου μέσου πλήρους ανάπτυξης για να απενεργοποιήσετε τη θρυψίνη. Διασκορπίστε απαλά το μέσο περνώντας με πιπέτα πάνω από την επιφάνεια του κυτταρικού στρώματος αρκετές φορές για να διασφαλίσετε την ανάκτηση του >95% των κυττάρων.
Πώς μπορώ να σταματήσω τη δραστηριότητα θρυψίνης;
Η πέψη της θρυψίνης μπορεί να σταματήσει με κατάψυξη ή με μείωση του pH της αντίδρασης κάτω από pH 4 με την προσθήκη μυρμηκικού, οξικού ή τριφθοροξικού οξέος (η θρυψίνη θα ανακτήσει τη δραστηριότητα όταν η Το pH αυξάνεται πάνω από το pH 4). Τα δείγματα που έχουν υποστεί πέψη μπορούν να αποθηκευτούν στους -20°C.
Τι εξουδετερώνει τη θρυψίνη;
Ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει ιόντα ασβεστίου και μαγνησίου θα επιβραδύνει επίσης τη δραστηριότητα της θρυψίνης. Ωστόσο, το FBS είναι ο πιο αποτελεσματικός τρόπος για την αναστολή της δραστηριότητας της θρυψίνης.
Ο ορός απενεργοποιεί τη θρυψίνη;
Ο ορός απενεργοποιεί την υπολειμματική θρυψίνη που απομένει από την ενζυματική πέψη των νεφρών και τα πρωτεολυτικά ένζυμα που συντίθενται στη συνέχεια από τα κύτταρα. Τα πρόσφατα θρυψινοποιημένα κύτταρα θα μπορούσαν να αναπτυχθούν σε μονοστιβάδες απουσία ορού, υπό τον όρο ότι πλύθηκαν επανειλημμένα για να αφαιρεθεί η υπολειμματική θρυψίνη.
Πόσα μέσα χρειάζονται για να απενεργοποιηθεί η τρυψίνη;
Όσο χρησιμοποιείτε τουλάχιστον 1:1 αναλογία μέσου 5-10% που περιέχει ορό με τη θρυψίνη σας, θα πρέπει να υπάρχει περισσότερο από επαρκής αναστολή, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση και μέτρια ανταλλαγή με φρέσκο μέσο.
