Πρώτα απ' όλα, τόσο το EcoR1 όσο και το Xba1 αφήνουν προεξοχές 5' όταν χωνεύουν το DNA (όπως και το Nde1). Και στις δύο περιπτώσεις το άκρο 3' είναι σε εσοχή και γι' αυτό η πολυερμάση μπορεί να προσθέσει βάσεις. Δεύτερον, όλες οι πολυμεράσες μπορούν να προσθέσουν βάσεις μόνο σε ένα άκρο 3', επομένως το Klenow θα προσθέσει 4 βάσεις στο υποχωρημένο άκρο 3' και των δύο θέσεων για να δημιουργήσει αμβλεία άκρα.
Τα ένζυμα περιορισμού αφήνουν 5 φωσφορικά;
Οι φορείς και τα ένθετα που χωνεύονται από ένζυμα περιορισμού περιέχουν τις απαραίτητες τερματικές τροποποιήσεις (5' φωσφορικό και 3' υδροξύλιο), ενώ τα θραύσματα που δημιουργούνται από την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) μπορεί όχι.
Μπορούν να συνδεθούν τα αμβλεία άκρα;
Σύνδεση με αμβλύ άκρο
Η απολίνωση με αμβλύ άκρο δεν περιλαμβάνει ζευγάρωμα βάσεων των προεξεχόντων άκρων, επομένως οποιοδήποτε αμβλύ άκρο μπορεί να απολινωθεί σε άλλο αμβλύ άκρο. Τα αμβλεία άκρα μπορεί να δημιουργηθούν από περιοριστικά ένζυμα όπως το SmaI και το EcoRV.
Η πολυμεράση Taq παράγει αμβλεία άκρα;
Yes… Η πολυμεράση Taq προσθέτει A-Overhangs εάν διατηρήσετε το τελικό βήμα επέκτασης στους 72 dC στην PCR. Χρησιμοποιείται κυρίως για κλωνοποίηση TA.
Γιατί να χρησιμοποιήσω το θραύσμα Klenow στον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA;
Το τμήμα Klenow είναι εξαιρετικά χρήσιμο για εργασίες που βασίζονται στην έρευνα, όπως: Σύνθεση δίκλωνου DNA από μονόκλωνα πρότυπα . Γέμισμα των υποχωρημένων 3' άκρων των θραυσμάτων DNA για να γίνει αμβλύ η προεξοχή 5' . Απομάκρυνση των προεξεχόντων προεξοχών 3'.
